Отчет по изучению патофизиологических механизмов противоопухолевой активности Флараксина
Институт глазных болезней и тканевой терапии имени В.П.Филатова
Кафедра онкологии
Руководитель исследования:
к.м.н., профессор - Александр Валентинович Артёмов
Цель работы
Изучение патофизиологических механизмов реализации противоопухолевого эффекта Флараксина.
Методы исследования
Клинические наблюдения 40 онкобольных с различными формами и стадиями, получавшими Флараксин. Исследовали онкоассоциированные белки (ОАБ) методом амперометрического титрования (патент №22989 А, заяв. 30.05.97 г.)
Установлено
Флараксин даёт наиболее высокий уровень селективного связывания с ОАБ по сравнению с цитостатиками (ВИНБЛАСТИН, ЦИКЛОФОСФАН). Флараксин наряду с цитостатиками не вызывает микроденатурационных изменений сывороточных белков (отсутствие селективного связывания) у неонкологических больных и доноров. Вместе с тем Флараксин выявил нехарактерную для цитостатиков способность реагировать на белки беременных (10-14 нед.) примерно на том же уровне, что и при онкопроцессе. Это позволяет предположить, что противоопухолевый эффект Флараксина в какой-то мере обусловлен микроденатурационными изменениями онкофетальных белков. Это ведет к нарушению метаболизма опухолевой клетки, а в отдельных случаях запускает механизм апоптоза опухолевой клетки. Последнее объясняет случаи клинического излечения Флараксином онкобольных с запущенными стадиями. Однако чаще Флараксин оказывает паллиативный эффект у таких больных, что вполне объяснимо известным фактом подавления экспрессии генов апоптоза опухолевых клеток. Использование Флараксина на ранних стадиях (после радикального удаления опухоли) показало выраженную нормализацию уровня онкоассоциированных белков (ОАБ) и иммунологического фона.
Вывод
Флараксин обладает способностью к микроденатурационным изменениям онкофетальных белков, что вызывает нарушение метаболизма опухолевой клетки (противорецидивное действие), а при определенных ситуациях запускает механизм апоптоза (канцеролитическое действие).
Руководитель исследования:
Зк.м.н., профессор - Александр Валентинович Артёмов
Отчет по изучению патофизиологических механизмов противоопухолевой активности Флараксина
Институт глазных болезней и тканевой терапии имени В.П.Филатова
Главный госпиталь Южного оперативного командования
Лаборатория иммунологии 411
Цель работы
Изучение патофизиологических механизмов реализации противоопухолевого эффекта Флараксина.
Флараксин - противоопухолевый препарат растительного происхождения - одно из немногих лекарственных средств, с выраженным канцеролитическим эффектом при практическом отсутствии токсичности (ЛД50 для грызунов в пределах 115-350 мг/кг массы). Проведенные в ряде ведущих научных учреждений АН Украины исследования показали, что флараксин обладает антиоксидантными свойствами, стимулирует выработку эндогенного интерферона и фактора некроза опухоли. Вместе с тем, опыт клинического применения флараксина, в частности те случаи, когда препарат дает полную клиническую ремиссию опухолевого процесса, сопровождающуюся рассасыванием опухолевых узлов, позволяют усомниться, что подобный эффект обусловлен лишь перечисленными выше свойствами препарата. Вполне логично предположить, что флараксин способен оказывать прямой цитотоксический эффект в отношении опухолевых клеток, как это показано для близкого к нему по нетоксичности противоопухолевому препарату «Украин». В этой связи представляет интерес феномен избирательного цитопатического действия флараксина только на опухолевые клетки, причем в отличие от цитостатиков, препарат действует на доброкачественные опухоли.
Для выяснения этого универсального механизма антипролиферативного действия флараксина мы обратились к недавно установленному феномену селективного связывания цитостатиков с сывороточными белками онкобольных. На основе данного феномена разработан и запатентован диагностический тест. Однако, по нашему мнению, явление селективного связывания противоопухолевых препаратов с онкоассоциированными белками открывает новые перспективы в изучении механизма их действия на опухолевый процесс.
Материалы и методы
Исследование выполнено на 40 больных с различными формами и стадиями злокачественного онкопроцесса, а также 10 больных с неопухолевой патологией и доброкачественными опухолями. Объектом исследования служила сыворотка крови пациентов, в которой определяли содержание SH групп до и после взаимодействия с противоопухолевыми препаратами. Так, получаемая сыворотка разделялась на несколько частей, в соответствии с используемыми для тестирования препаратами. После инкубации в течение 2 часов при t 37°С в соотношении 10:1 (сыворотка : препарат) амперометрическим титрованием определилось количество свободных небелковых в мкм/л. В контрольной пробе сыворотка была без добавления препаратов.
В качестве реагентов использовались следующие препараты: «Винбластин» (фирма «Гедеон Рихтер»), «Циклофосфан» (АО «Биохимик»), «Украин» (Вена, «Новицкафарм»), «Флараксин» (Харьков, «ПНЛФ Феникс»). Исследования выполнены на базе Лаборатории Иммунологии 411 Главного госпиталя Южного оперативного командования (Одесса).
Результаты и их обсуждение
У большинства исследованных нами онккобольных в сыворотке крови был довольно высокий уровень небелковых SH групп: М±м =17,1±7,4мкм/л. Это обусловлено тем, что большинство больных были с запущенными стадиями ракового процесса, сопровождающимися, как известно, нарушениями гемореологического гомеостаза. Наличие свободных небелковых SH групп в этой ситуации отражает конформационную нестабильность сывороточных белков на фоне преобладания катаболических процессов. В связи с наличием исходного уровня небелковых SH групп в нативной сыворотке, абсолютные показатели селективного связывания для Винбластина и Циклофосфана были выше, чем в ранее проводившихся исследованиях (Табл. 1).
| Реакционная смесь | Уровень небелковых SH групп, мкм/л М±м |
|---|---|
| СК + Винбластин | 18,4±8,3 |
| СК + Циклофосфан | 20,7±7,1 |
| СК + Украин | 23,6±5,7 |
| СК + Флараксин | 32,2±9,9 |
Примечание: Здесь и в последующих таблицах приняли следующие условные обозначения: СК – сыворотка крови.
Из приведенной выше таблицы видно, что Флараксин дает самые высокие показатели селективного связывания с белками сыворотки крови у больных. Интерпретация этого феномена, по нашему мнению, напрямую связана с анализом патофизиологических механизмов противоопухолевой активности препарата. Если говорить о цитостатиках, то их способность к селективному связыванию с онкоассо-циированными белками не имеет прямого отношения к противоопухолевой активности. Цитостатики обладают также и другими реакционно-способными группировками, вызывающими денатурационные изменения не только опухолеспецифичных белков, но и физиологически необходимых белков здорового организма. В представленном тесте затронут только узкий круг белков, присущих опухолевому процессу и имеющих лабилизированные тиолодисульфидные связи. Так как флараксин не обладает повреждающим действием на белки нормальных тканей, то вполне логично предположить, что его противоопухолевый эффект реализуется преимущественно через денатурационные повреждения лабилизированных по SH-SS группам онкоассоциированных белков. Это же мы можем сказать и в отношении другого нетоксичного препарата «Украина».
Сказанное выше относится исключительно к больным злокачественными формами опухолевого процесса. При исследовании сыворотки крови у больных с доброкачественными опухолями обнаружилась неожиданная картина. Так, нами была исследована сыворотка крови у больных с фиброзно-кистозной мастопатией (4 случая), фибромиомой матки (2 случая), аденомой простаты (1 случай), аденомой щитовидной железы (1 случай). Ни в одном случае Винбластин и Циклофосфан не дали селективного связывания с белками сыворотки крови, флараксин дал связывание в 7 из 8 случаев. Украин - в 6 случаях. Средние показатели для флараксина составили: 8,5±3,2 мкм/л.
Выявленная нами способность флараксина связываться с белками сыворотки крови больных доброкачественными опухолями, т.е. способность к денатурационным повреждениям онкоассоциированных белков, вполне согласуется с выдвинутым выше предположением о том, что противоопухолевый эффект препарата реализуется через этот механизм. Как известно, цитостатики не действуют на доброкачественные опухоли, они же и не дают денатурационных повреждений (речь идет только о повреждениях, реализуемых через тиолодисульфидные связи) белков, имеющих место при доброкачественных опухолевых процессах.
И наконец, при случайных исследованиях сыворотки крови у беременных (2 случая) нами была обнаружена довольно высокая селективная связь по отношению к флараксину М±м = 25,6±0,4 мкм/л. Ни цитостатики, ни Украин в этих случаях селективного связывания не обнаружили. Таким образом, есть основания считать, что флараксин реализует свой антипролиферативный эффект через денатурационные повреждения онкофетальных белков. Эти повреждения осуществляются благодаря конформационной уязвимости (лабилизированию) тиолодисульфидных связей в этой группе белков. Возможно, что такая конформационная уязвимость онкоассоциированных белков и белков эмбрионального периода обусловлена выполнением ими исключительно пролиферативной функции, требующей иного уровня третичной организации белка.
Основные выводы
- Флараксин, наряду с цитостатиками, обладает способностью к денатурационным повреждениям онкоассоциируемых белков, реализуемым через лабилизированные тиолодисульфидные связи.
- В отличие от цитостатиков флараксин оказывает денатурационный эффект отмеченного выше типа на белки сыворотки крови больных доброкачественными опухолями и беременных.
- Противоопухолевый эффект флараксина обусловлен его универсальным антипролиферативным свойством, реализуемым через механизм денатурационного повреждения лабилизированных по тиолодисульфидным связям белков, участвующих в пролиферативном процессе.
Руководитель исследования:
Институт глазных болезней и тканевой терапии имени В.П.Филатова:
к.м.н., профессор - Александр Валентинович Артёмов
Постановка теста на селективное связывание
(патент №22989 А, заяв. 30.05.97 г.)
- Забор из вены не менее 10 мл крови.
- Получение сыворотки, разделение ее на равные части по числу тестируемых препаратов, одна часть - контроль.
- Во все части, кроме контроля, добавляют реагент в соотношении 10:1. Разведение реагента надо подбирать эмпирически.
- Смесь сыворотки с реагентом инкубируется 2 часа при t 37°С.
- После инкубации производится депротеинизация сыворотки.
- В депротеинизированной сыворотке определяются свободные небелковые SH группы.
Для спектрофотометрического определения SH групп надо подобрать степень разведения реагентов (цитостатиков, флараксина или др.).
Подбор разведения препаратов
- Сначала берется терапевтическое разведение.
- Затем на здоровых донорах производят определение небелковых SH-групп в контрольной пробе и после добавление препарата. Правильно подобранное разведение не должно вызывать прибавления SH-групп по сравнению с контролем. Если этого нет, то терапевтическое разведение надо разводить дольше.
